本文介绍三代hifi基因组测序的组装。
1.HiFi测序
HiFi reads（High fidelity reads）是Sequel II三代测序平台推出的兼顾长读长和高准确度的测序序列，2019年由PacBio公司推出，一般采用CCS（Circular Consensus Sequencing）模式测序，HiFi测序能够产出既有较长读长（10-20kb）又具有高序列精度的测序结果（约99.9%）。
环化共有序列CCS的测序方式：构建一个环形的DNA文库，在这种测序模式下，酶读长一般大于插入片段(即被测序片段)长度，因此酶会绕着模板进行滚环测序，插入片段会被多次测序。单次测序中造成的随机测序错误，可以通过算法整合和自我纠错校正来去除，最终得到高准确度的HiFi reads。
适用于HiFi测序组装的软件有Flye、HiCanu(是Canu软件专门针对HiFi reads优化版本)、hifiasm(速度快、专注解析单倍型)。
2.HiFi测序下机数据
Sequal平台的下机数据主要有三种：bam文件、bam.pbi文件、xml文件。
2.1 BAM文件
Pacbio下机数据中的BAM文件是没有比对过的，用于储存序列。
第一列：reads信息
{movieName}/{holeNumber}/{qStart}_{qEnd}
(对于CCS：{movieName}/{holeNumber}/ccs)
MovieName 是cell的名字，holeNumer是ZMW孔的编号，qStart和qEnd是subreads相对于ZMW reads的位置。
第二列 (sum of flags)：比对信息，均为4 代表没有比对上，也表明了bam文件只储存了序列信息，而没有比对信息。
第三列 (RNAM)：参考序列，值为*，代表无参考序列
第四列 (position) : 比对上的第一个碱基位置 0
第五列 (Mapping quality) : 比对质量分数 255
第六列 (CIGAR值) : 比对的具体情况
第七列 (MRNM, ) : mate 对应的染色体
第八列 (mate position) : mate对应的位置 0
第九列 (ISIZE, Inferred fragment size) : 推断的插入片段大小 0
第十列 (Sequence) : 序列信息 具体的ATCG
第十一列 (ASCII码) : 碱基质量分数 ASCII+33
第十二列 : 可选区域记录Reads的总体属性包括信号长度，信号强度等信息。
2.2 bam.pbi
BAM文件的索引文件。
3.hifi reads组装
3.1 flye组装
用flye进行组装，输入是测序的fasta或fastq文件，所以需要将下机bam文件转换为fasta文件。bam2fastx软件可以实现转换，也可使用samtools转换。
1 | # bam to fasta |
完成转换之后，可以用flye进行组装。
1 | # assembly |
组装结果，输出文件：
assembly.fasta:最终组装结果
assembly_graph.gfa/assembly_graph.gv:
assembly_info.txt:
3.2.hifiasm组装
hifiasm擅长组装单倍型，其组装有三种模式：只有hifi reads、Hifi reads+ Hi-C、hifi reads＋双亲二代测序的Trio-binning。
hifiasm安装
1 | #install |
hifiasm组装，输出为assembly.fa
1 | # 只有hifi reads |
4. quast评估
完成基因组组装之后，要用quast评估组装结果，quast主要是计算contigs数量、总长度、N50、N90、L50、GC rate等等，可以根据参考基因组进行评估，也可以不依据参考基因组进行评估。软件使用：
1 | #install |
评估指标：
1.contig size
No. of contigs: 组装中的 contigs 总个数。
Largest contig: 最长 contig 的长度。
Total length: assembly 中的碱基总数。
Nx (where 0<=x<=100): 最长长度的 contigs 占组装碱基的百分比。
NGx, Genome Nx: 相等或更长的重叠群产生参考基因组长度的 x% 的重叠群长度，而不是组装结果长度的 x%。
2.基因组相关统计
Genome fraction (%) : 基因组中被组装结果覆盖到的碱基数 除以 参考序列的总长度得到的比值；位于重复区域的contig可能会比对到多个位置，因此会被重复计算。
Duplication ratio：组装结果中可比对到基因组的碱基数 与 基因组中被覆盖到的碱基数的比值；如果组装的结果中重复序列较多，多个contig覆盖同一个基因组区域的话，这个值会大于1。这种情况可能是由于过多的估计了重复序列的拷贝数。
Largest alignment：将组装结果同基因组进行比对，得到的最大的连续的比对的长度；这个值一般会同largest contig相同，但是如果larget contig有些missassembled，或者部分未比对上去的话，会相对小一些。
Total aligned length：组装结果中可比对到基因组的碱基数，由于存在未比对和部分未比对，这个数字一般会小于组装的结果的总长度（total length)。
3.组装错误等，这些只能根据已知参考基因组进行评估。
No. of misassemblies: 组装错误的数量。
No. of misassembled contigs: 包含错误组装断点的 contigs 数量。
Misassembled contigs length: 在所有 contig 中包含一个或多个错配的碱基总数。
No. of unaligned contigs: 与参考序列没有对齐的 contigs 数量。
No. of ambiguously mapped contigs: 在参考基因组的多个位置具有相同质量的高得分参考比对的 contigs 数量。
除了以上汇总统计数据之外，Quast 还生成包含每个 contig 详细信息的报告，包括 contig 是否未对齐、不明群映射、错误组装或正确。
4.未比对上的。
fully unaligned contigs：没有比对上参考基因组的contig数
Fully unaligned length：没有比对上参考基因组的contig总长度
partially unaligned contigs：部分没有比对上基因组的contig数，长度大于参数值（500bp）
Partially unaligned length：部分没有比对上基因组的contig中总的没有比对上的碱基数
5.错配的
mismatches ：所有比对上的碱基中，mismatch的个数
indels ：所有比对上的碱基中，indel的个数
Indels length ：indel的总长度
mismatches per 100 kbp：每100kbp中，mismatch的个数
indels per 100 kbp : 每100kbp中，indel的个数
indels (<= 5 bp) : 长度小于5的indel个数
indels (> 5 bp) : 长度大于5bp的indel个数
N’s ：N碱基的个数
N’s per 100 kbp：每100kbp中N碱基的个数
5.进行polish
三代测序读长长，但是也有较高的错误率，组装完成后可以用pilon进行polish，可以用二代测序(pilon)或三代数据(gcpp或racon)再次纠错。这里，介绍gcpp，gcpp封装在pb-assembly中，可以通过conda安装pb-assembly,也可以直接安装gcpp。
1 | # use NGS pair end data or hifi reads to polish, here, we use hifi reads to polish hifi-assembly |
6.busco评估基因组组装完整性
conda install -c bioconda busco
待更新