Xueyd's Blog

0%

scRNA-seq分析之cellranger count

发表于 更新于 分类于 ，
本文字数： 895 阅读时长 ≈ 1 分钟

本文介绍从fastq文件开始，用cellranger进行定量：

  • 用cellranger构建参考基因组
    • cellranger mkgtf
    • cellranger mkref
  • cellranger count

1. 生成cellranger参考基因组

cellranger官方提供有小鼠和人类的参考基因组，其他物种的需要用mkref自己产生。

1.1 生成用于产生参考基因组的gtf文件

–attribute参数用于指定gtf文件中的biotype。

1
2
3
4
cellranger mkgtf Dmel.gtf Dmel.BDGP6.32.104.filtered.gtf \
--attribute=gene_biotype:protein_coding \
--attribute=gene_biotype:lncRNA \
--attribute=gene_biotype:antisense

1.2 生成参考基因组文件

接下来根据上一步产生的gtf文件生成参考基因组文件，–genome参数指定接下来产生的参考基因组的文件夹名字，–fasta为下载的参考基因组的序列文件，–gtf为上一步产生的gtf文件。

1
2
3
cellranger mkref --genome=Dmel.genome \
--fasta=Dme.dna.fa \
--gtf=Dmel.BDGP6.32.104.filtered.gtf

2. cellranger count定量

有了fastq和参考基因组，接下来就可以定量了。
–id输出文件夹名字，–transcriptome参考基因组所在的文件夹，–fastqs为fastq序列所在的文件名，–sample用于分析的文件prefix，–localcores线程数，–localmem内存数，加上–nosecondary参数不进行下游聚类分析。

1
2
3
4
5
6
7
cellranger count --id=run_sample1 \
--fastqs=/storage/XYD/mywork/fastq \
--sample=sample1-44,sample1-48,sample1-49,sample1-56 \
--transcriptome=/storage/XYD/00.reference/01.Dmel/Dmel.genome \
--localcores=12 \
--localmem=128 \
--nosecondary

定量结束之后，产生的文件夹里outs/下会有一个网页文件web_summary.html，打开会看到下图的信息。

alt 图标

发现有个warning：Low fraction reads in cells，显示我的数据大概在54％左右，理想情况下应该为70%，官方的解释有两种可能：1.环境RNA水平过高；2.有一部分细胞RNA content很低，若是第二种情况，那么可以在count步骤加上–force-cells参数，设置一下自己预期的细胞数量，从而去掉RNA含量低的细胞。但是我设置了这个参数之后，还是会有这个warning，这可能说明细胞中reads比例低不是第二种情况造成的。

1
2
3
4
5
6
7
8
cellranger count --id=run_sample1 \
--fastqs=/storage/XYD/mywork/fastq \
--sample=sample1-44,sample1-48,sample1-49,sample1-56 \
--transcriptome=/storage/XYD/00.reference/01.Dmel/Dmel.genome \
--localcores=12 \
--localmem=128 \
--nosecondary
--force-cells=13000

参考资料：
1.https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360003919491-How-to-interpret-the-Fraction-Reads-in-Cells-metric-